ПЦР правила

ПЦР правила * ПЛР правілы * PCR rules — правила, которым необходимо строго следовать при работе с использованием ПЦР метода. Эта необходимость продиктована высокой чувствительностью метода и требованием чистоты эксперимента, т. е. не допускать загрязнения образцов, которое приведет к получению ложных результатов. 1. Работа, предшествующая ПЦР (выделение образцов ДНК, приготовление реакционной смеси), и работа, включающая проведение ПЦР, а также анализ ее продуктов, должны осуществляться в раздельных помещениях. 2. Рекомендуется использовать ламинар-боксы, оборудованные источниками УФ-света. 3. Необходимо использовать новые одноразовые перчатки на каждой стадии подготовки и проведения ПЦР. 4. Необходимо использовать специально сконструированные для ПЦР дозаторы и наконечники с аэрозольными фильтрами. 5. Реагенты для ПЦР должны готовиться раздельно и использоваться исключительно для этой цели. 6. Растворы должны быть разделены на минимальные аликвоты и храниться отдельно от образцов ДНК. 7. Необходимо всегда ставить отрицательную контрольную реакцию, в которую входят все компоненты реакционной смеси и анализируемой пробы, кроме исследуемой ДНК. Кроме того, необходимо соблюдать общую культуру работы в лаборатории, которая подразумевает проведение процедур, обеспечивающих стерильные и чистые условия (использование одноразовой посуды, регулярная влажная уборка помещений, регулярная обработка рабочего места и т. д.). Очень важно хранить реактивы не целиком, а небольшими порциями (аликвотами), поскольку при обнаружении загрязнения приходится уничтожать все реактивы. Загрязнение может произойти в результате случайного внесения в образец посторонней последовательности-мишени. Это может случиться на любом этапе: при получении образца, выделении ДНК, на стадии амплификации. Поскольку при ПЦР происходит экспоненциальное увеличение числа копий последовательности-мишени, то ложноположительный результат может получиться при минимальном количестве посторонней ДНК, вплоть до одной молекулы. Поэтому при работе необходимо соблюдать такие же строгие меры предосторожности, как и те, что используются в микробиологии. Загрязнения можно разделить на случайные и повсеместные. Во втором случае положительный сигнал дает как большинство анализируемых образцов, так и отрицательный контроль. Этот тип загрязнений легко выявляется с помощью системы контролей. Случайные загрязнения гораздо сложнее выявить, поскольку загрязненными оказываются отдельные образцы ДНК или пробирки для ПЦР. Ложноположительный результат возникает непредсказуемым образом и распознается с большим трудом.